Metabolik mühendislik yöntemleriyle modifiye edilmiş Pichia pastoris kullanılarak transglutaminaz üretimi
Tez Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoteknoloji Anabilim Dalı, Türkiye
Tez Danışmanı: Pınar Çalık
Tezin Onay Tarihi: 2012
Tezin Dili: İngilizce
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Desteklendiği Program: Diğer
Özet:
Transglutaminazlar (EC 2.3.2.13) proteinlerin glutaminil gruplarının γ- karboksil grupları ve lisin de dahil olmak üzere çeşitli birincil aminler arasında gerçekleşen açil transfer reaksiyonunu katalizleyen enzimlerdir. Transglutaminaz enzimi, yeni fonksiyonel özelliklerde protein üretimi, elzem amino asitlerin yapıya eklenmesi ile gıdaların besin değerinin geliştirilmesi, ısıya dayanıklı jellerin oluşturulması, gıdaların reolojik özelliklerinin ve mekanik dayanımının geliştirilmesi ve gıda katkı maddelerinin kullanımının azaltılması için kullanılma potansiyeline sahip bir enzimdir.
Bu yüksek lisans çalışmasının amacı, hücreiçi ve hücredışı mikrobiyal protransglutaminaz (pro-MTG) üreten rekombinant Pichia pastoris suşlarının metabolik mühendislik teknikleri kullanılarak geliştirilmesidir. Bu kapsamda ilk olarak, Streptomyces mobaraensis’in protransglutaminaz geni hücreiçi ve hücredışı olarak ayrı ayrı üretim yapmak amacıyla pPICZα-A ekspresyon vektörlerine ayrı ayrı klonlanmıştır. Hücreiçi (pPICZαA::pro-mtgintra) ve hücredışı (pPICZαA::pro-mtgintra) üretim için geliştirilen plazmidler P. pastoris X33 genomunda bulunan AOX1 lokusuna klonlanmış ve pro-mtg geninin metanolle indüklenen alkol oksidaz promoter vasıtasıyla ekspresyonu sağlanmıştır. Rekombinant Pichia pastoris suşlarının hazırlanmasından sonra, kesikli çalkalayıcılı biyoreaktör deneyleri her bir rekombinant hücre için yapılmış ve en iyi üretim yapan suşlar Dot blot ve SDS-PAGE analizleri ile seçilmiştir. Genomlarında pPICZαA::pro-mtgextra ve pPICZαA::pro-mtgintra genlerini taşıyan seçilmiş rekombinant hücreler sırasıyla E8 ve I1 olarak adlandırılmışlardır. Pilot ölçekli 1 L çalışma hacmına sahip kontrollu biyoreaktör deneyi E8 klonu ile gerçekleştirilmiş ve üretilen pro-MTG Dispase I ile aktive edilerek MTG enzimi elde edilmiştir. Biyoproses süresince rekombinant MTG aktivitesi, hücre derişimi, toplam proteaz aktivitesi, AOX aktivitesi ve organik asit derişimlerindeki değişimler analiz edilerek spesifik çoğalma hızı, spesifik tüketim hızı ve verim katsayıları hesaplanmıştır. Maksimum 4448 U L-1 MTG aktivitesi ve maksimum 74.1 g L-1 hücre derişimi t=36 st’te elde edilmiştir. Bu çalışmayla, Pichia pastoris tarafından hücre dışı aktif transglutaminaz enzim üretimi ilk kez gerçekleştirilmiştir ve üçüncü en yüksek hücre dışı MTG aktivitesi E8 klonu ile elde edilmiştir.