Pichia pastoris alkol dehidrojenaz 2 ve alkol oksidaz 1 promotorlarının transkripsiyon mühendisliği ile rekombinant protein üretimi için geliştirilmesi

---

Dr. Öğr. Üyesi Burcu GÜNDÜZ ERGÜN

Tez Türü: Doktora

Tezin Yürütüldüğü Kurum: Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoteknoloji Anabilim Dalı, Türkiye

Tez Danışmanı: Pınar Çalık

Tezin Onay Tarihi: 2018

Tezin Dili: İngilizce

Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu

Desteklendiği Program: Diğer

Özet:

Doktora tezinin amacı rekombinant protein (r-protein) üretiminin artırılması için güçlü, etanol ile regüle edilen promotor varyantlarının tasarlanması ve geliştirilmesi, ve belirlenen transkripsiyon faktörlerinin (TF) P. pastoris ADH2 (P_ADH2) ve AOX1 (P_AOX1) promotorlarının regülasyonunda rollerinin araştırılmasıdır. P_ADH2 promotor mimarisi nükleozom optimizasyonu ve transkripsiyon faktörü bağlanma bölgelerinin modifikasyonu ile değiştirilmiş, etanolün karbon ve enerji kaynağı olarak kullanılacağı P_AOX1 indüksiyon mekanizması yeniden tasarlanmıştır. Adr1 (Mxr1), Aca2, Cat8, ve TATA bağlanma motifleri P_ADH2 ve P_AOX1 promotor varyantlarını içeren kütüphanelerinin tasarlanması ve oluşturulmasında kullanılmıştır. Geliştirilen yeni promotor varyantlarının güçleri ilk aşamada farklı fermentasyon ortamlarında hücre içi model protein, güçlendirilmiş yeşil floresan protein (eGFP) üretimi ile araştırılmıştır. Doğal P_ADH2‘ye göre, P_ADH2 varyantları %476 daha fazla eGFP sentezi gerçekleştirmiştir. P_AOX1 varyantları etanol indüksiyonu koşulunda doğal promotorun (P_AOX1-wt) %74’ü ile %130’u arasında aktivite göstermiş, methanol indüksiyonu altında P_AOX1-wt’in %197’si kadar eGFP üretimi gerçekleştirmiştir. eGFP transkript düzeylerinin ölçümü ile geliştilen promotor varyantları P_ADH2-OptCat, P_ADH2-NucOpt, P_ADH2-AddCat, P_{ADH2-NucOpt-OptCat}, P_AOX1-Cat3, P_AOX1-Aca, ve P_AOX1-mod’un güçlendirilmiş transkripsiyon kapasiteleri doğrulanmıştır. Geliştirilen promotor varyantlarının potansiyellerinin değerlendirilmesi için öne çıkan üç promotor varyantı P_ADH2-NucOpt, P_ADH2-OptCat, ve P_AOX1-mod ile hücre dışı serum albumin üretimi (hSA) gerçekleştirilmiştir. Etanol indüksiyonu ile fermentasyon deneylerinde, P_ADH2-wt, P_ADH2-NucOpt, P_ADH2-OptCat, ve P_AOX1-mod promotor varyantları altında sırası ile birim yaş hücre ağırlığı başına üretilen ortalama hücredışı hSA verim katsayıları (Y_P/X) 0.26, 0.38, 1.13, ve 0.48 mg/g olarak hesaplanmıştır. Metanol içeren tanımlı besiyerinde P_AOX1-wt ve P_AOX1-mod  ile Y_P/X değerleri  0.85 ve 1.34 mg/g olarak bulunmuştur. Adr1 (Mxr1), Aca1, Cat8-1, ve Cat8-2 transkripsiyon faktörlerinin P_ADH2 ve P_AOX1 regülasyonunda rollerinin belirlenmesi için TF aşırı üreten (OE) ve TF genin silindiği (KO), P_ADH2 ve P_AOX1 kontrolünde eGFP üreten suşlar geliştirilmiştir. Limitli glikoz ve yüksek derişimde gliserol içeren ortamlarda, Cat8-2 aşırı üretildiğinde P_ADH2, etanol ile indüklenmiş hücrenin, 37% ve 33%’ü kadar eGFP sentezi yapabilmektedir. P_ADH2’nin aktivitesi cat8-1Δ suşu ile etanol indüksiyonu altında %128’e; adr1Δ suşu ile methanol indüksiyonunda %183’e yükselmiştir. Adr1 aşırı üreten hücrelerde, metanol indüksiyonu altında P_AOX1 aktivitesi %345’e yükselmiştir. Etanol ve methanol ile indüklenen ve Adr1’i aşırı üreten hücrelerde P_AOX1-mod ekspresyon gücü sırasıyla doğal promotorun %444 ve %383’üne yükselmiştir. Geliştirilen yeni promotor varyantları ve transkripsiyon mühendisliği ile tasarlanan r-protein üretim platformlarının endüstriyel r-protein üretim prosesleri için yüksek potansiyele sahip adaylar olduğu elde edilen sonuçlarla kanıtlanmıştır.