Rekombinant transmembran proteinlerin kromatografik yöntemlerle saflaştırılması
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Yıldız Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2023
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: LEVENT TURA
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): Murat Topuzoğulları
Eş Danışman: Tülin Özbek
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Son yıllarda bakterilerin antibiyotiklere karşı geliştirdikleri dirençte önemli bir artış olması, Staphylococcus aureus (S. aureus) gibi birçok patojenden kaynaklı hastalıkların tedavisini zorlaştırmaktadır. Bu sebeple, bu tip patojenlere karşı yeni tedavi yöntemlerinin ve ilaç moleküllerinin geliştirilmesi elzem hale gelmiştir. Bu amaçla geliştirilen ve rekombinant olarak üretilen antibakteriyel etkili transmembran proteinlerin dirençli patojenlere karşı kullanılabilecek önemli bir strateji olduğu yapılan çalışmalarda gösterilmiştir. Ancak, transmembran proteinlerin ekspresyonu sonrası lipit çift tabakaya çok geçişli olarak konumlanması, bu proteinlerin rekombinant üretimi sonrasında saflaştırılmasında çeşitli zorlukları beraberinde getirmektedir. Rekombinant transmembran proteinlerin lipit çift tabakada bulunan α-sarmal kısımları proteine hidrofobik bir özellik katmaktadır. Bu durum, kolon kromatografisi için etkin ve yüksek verimli bir metodun geliştirilmesini gerektirmektedir. Çalışmada, S. aureus patojenine karşı antibakteriyel aktivite göstermesi öngörülen bir transmembran proteininin kromatografik yöntemlerle saflaştırılması amaçlanmıştır. Çalışılan transmembran proteinin kromatografik saflaştırmasının tasarımından önce saflaştırma etkinliğini en üst düzeye çıkarabilmek amacıyla disülfit bağı potansiyeli, hidrofobik amino asitlerin bulunma sıklığı, zincir uzunluğu ve moleküler ağırlığı gibi veriler değerlendirilmiştir. Hedef rekombinant proteinin histidin ve GST etiketlerine sahip olması nedeniyle öncelikle HisTrap™ FF ve GSTrap™ kolonları ile afinite kromatografisi uygulanmıştır. Sonrasında, proteinin hidrofobik özelliğinden yararlanarak HiTrap™ Butyl HP kolonu ile tuz ortamında artan hidrofobisite ilkesi ışığında saflaştırma yöntemi oluşturulmaya çalışılmıştır. Son olarak ise, ilgili rekombinant proteinin teorik izoelektrik noktası hesaplanarak HiScreen™ Capto DEAE kolonu ile iyon değişim kromatografisi, farklı gradient türleri ile artan iyonik yük koşulunda uygulanmıştır. Gerçekleştirilen afinite kromatografileri ve hidrofobik etkileşim kromatografisi yöntemleri ile yüksek saflıkta protein saflaştırılması gerçekleştirilememiş olmasına rağmen iyon değişim kromatografisi ile önemli ölçüde saf fraksiyonlar elde edildi. Elde edilen saf fraksiyonların SDS-PAGE, Western blot ve MALDI TOF kütle spektroskopisi gibi karakterizasyon analizleri gerçekleştirilerek hedef rekombinant proteinin yapısı doğrulanmıştır. Farklı kromatografi türlerinin hedef rekombinant proteinin saflaştırma stratejisine etkisi araştırılarak, sağlık, gıda, tarım, kozmetik gibi bakteriyel kontaminasyonların sıkça rastlandığı alanlarda yüksek saflıkta antibakteriyel transmembran protein üretimi tartışılmıştır.