Kütanöz leishmaniasis etmeni l.tropica'dan izole edilen lpg molekülüne karşı hibridoma teknolojisine dayalı monoklonal antikorların büyük ölçek üretilmesi ve saflaştırılması
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Yıldız Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, BİYOMÜHENDİSLİK ANABİLİM DALI, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2017
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: HİLAL ŞENTÜRK
Danışman: Adil Allahverdiyev
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Leishmaniasis, Phlebotomus'un (enfekte kum sineklerinin) kan emme esnasında memeli konaklara bulaştırdıkları hücre içi Leishmania protozoonlarının oluşturduğu bir hastalıktır. Leishmaniasis'in; visseral, kütanöz ve mükokütanöz olmak üzere 3 klinik formu bulunmaktadır. Visseral leishmaniasis (VL), kronik bir hastalık olup, iç organ tahribatı ile ağır enfeksiyonlara hatta ölüme neden olabilmektedir. Kütanöz leishmaniasis (KL); L. tropica ve L. major'un neden olduğu ve genelde tropikal ve subtropik bölgelerde görülen, bir deri hastalığıdır. Kütanöz leishmaniasis, ülkemiz de dahil olmak üzere dünyanın yaklaşık 83 ülkesinde endemik olarak görülmektedir. Dünya genelinde olduğu gibi Türkiye'de de kütanöz leishmaniasis vakalarına daha sık rastlanmaktadır. 1988 ve 2010 yılları arasında Türkiye'de 50 bine yakın Kütanöz leishmaniasis vakasının Güneydoğu Anadolu Bölgesi civarında olduğu bildirilmiştir. Hastalığın tanısında; mikroskobik, kültür ve moleküler yöntemler kullanılır. Ancak, klasik kültür yöntemi ile mikroskobik yöntemin duyarlılığı örnekteki parazit sayısına bağlı olarak değişir. Özellikle Kütanöz leishmaniasis'in kronik ve iyileşmeyen formlarında duyarlılığı yaklaşık olarak %40 civarındadır. Klasik kültür yönteminden farklı olan mikro kültürü yöntemi (MKY); parazit sayısına bağlı olmaksızın en kısa sürede (1-3 gün) tayin etmesinin yanında, yüksek duyarlılık göstermesi ve ekonomik olmasına rağmen görüntülenebilmesi için inverted mikroskoba ihtiyaç duyulur. Leishmaniasis'in tanısında kullanılan serolojik yöntemlerin özellikle visseral leishmaniasis'e karşı yüksek duyarlılık (%80-90) gösterdiği bilinmektedir. Fakat kütanöz leishmaniasis'de oluşan hümoral yanıtın visseral leishmaniasis'e göre düşük olmasından dolayı antikor temelli serolojik yöntemler yetersiz kalmaktadır. Buna göre de, kütanöz leishmaniasis'in tanısında antijen temelli serolojik testlerin değeri daha çok önem kazanmaktadır. Ancak antijen temelli serolojik yöntemler, antijene karşı üretilmiş yoğun bir antikorun bulunduğu koşullarda gerçekleşebilir. Bu sebeple, kütanöz leishmaniasis tanısında veya tanı kitlerinin geliştirilmesi, ancak hibridoma teknolojisine dayalı üretilen poliklonal ve monoklonal antikorlar ile mümkün olabilir. Leishmaniasis'de hibridoma teknolojisine dayalı monoklonal antikorların geliştirilmesi ile ilgili literatürde az sayıda çalışma bulunmakta olup bunların çoğu visseral leishmaniasis üzerine yoğunlaşmaktadır. Kütanöz leishmaniasis ile yapılan tek çalışmada; L.tropica lizatına karşı poliklonal antikorlar üretilmiştir. Son yıllarda konu ile ilgili laboratuvarımızda hem VL hemde KL etmeni parazitlere karşı hibridoma teknolojisine dayalı poliklonal ve monoklonal antikorların üretimine yönelik çalışmalar tamamlanmış ve hala yürütülmektedir. Yapılan bu çalışmalar sonucunda, visseral leishmaniasis etmeni L. infantum' un 15kDa antijenine karşı spesifik olan monoklonal antikor ve kütanöz leishmaniasis etmeni L.tropica'ya karşı poliklonal antikorlar üretilmiştir. Ancak, şimdiye kadar kütanöz leishmaniasisin tanısında, L.tropica'nın yüksek immünojen özelliğine sahip yüzey antijenine karşı hibridoma teknolojisine dayalı monoklonal antikor üretilmesine yönelik herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Laboratuvarımızda TÜBİTAK kapsamında gerçekleştirilen "Leishmaniasis'e karşı aşı geliştirilmesinde polimerlere dayalı yeni bir yaklaşım: LPG-polimer konjugatları" projede; lipofosfoglikan (LPG) molekülü izole edilmiş ve bu molekülün Leishmaniasis'e karşı %83 oranında koruyuculuk gösterdiği saptanmıştır. LPG molekülünün böyle yüksek düzeyde antikor üretebilmesine rağmen, Leishmania'nın herhangi bir türünden izole edilmiş LPG molekülüne karşı hibridoma teknolojisine dayalı monoklonal antikor üretilmesine yönelik bir çalışma bulunmamaktadır. Bu açıdan, kütanöz leishmaniasis'de kullanılmak üzere geliştirilecek tanı kitinde, LPG molekülüne karşı üretilen monoklonal antikorların önemli rol oynayacağı düşünülmektedir. Bu bilgiler ışığında tezin amacı, Dünya'da ve ülkemizde L.tropica'nın en immünojen molekülü olan lipofosfoglikana (LPG) karşı hibridoma teknolojisine dayalı monoklonal antikorların üretilmesi, saflaştırılması ve kütanöz leishmaniasis tanısında kullanılmak üzere spesifikliğinin belirlenmesi üzerine kurulmuştur. Bu hedefe ulaşabilmek için; dişi BALB/c farelerine (6-8 haftalık), L.tropica'dan izole edilmiş immonejen lipofosfoglikan (LPG) molekülü ile birlikte Freund ve daha önceki çalışmalarımızda etkinliği belirlenmiş FDA onaylı Freund adjuvantına göre daha az toksik olan POX adjuvantının farklı kombinasyonları ile immünize edildi. Füzyon öncesi hibridoma kültürünün gelişimini desteklemek için fare periton makrofajları besleyici hücre hattı olarak kullanıldı. İmmünizasyon sonucu LPG'ye karşı kontrol grubu farelere göre yaklaşık 8,5 kat daha yüksek antikor yanıtının görüldüğü fare B- lenfosit kaynağı olarak füzyon çalışması için kullanıldı. Füzyon aşamasında yüksek immün yanıt gösteren fareden elde edilen dalak hücreleri ile fare myeloma hücreleri (P3-X63-Ag8.653) polietilen glikol (PEG-4000) varlığında füzyona uğratıldı. Füzyon çalışmasının yürütüldüğü 660 kuyunun 128 kuyusunda hibridoma hücresi görüldü. Fakat yapılan indrekt ELISA sonuçlarına göre sadece 16 kuyunun LPG'ye karşı antikor ürettiği tespit edildi. Antikor üretiminin en yüksek olduğu 8/E7 kuyusu alt klonlanarak monoklonal antikor üretiminin tek klon hibrid hücre tarafından üretilmesi sağlandı. 8/E7 klonundan çoğalan hibridoma hücreleri kademeli olarak büyük ölçek kültürü yapılarak elde edilen monoklonal antikorların HPLC ile saflaştırılma işlemi gerçekleştirildi. Saf olarak elde edilen monoklonal antikorların LPG molekülene olan spesifikliği Dot Blot analizi ile doğrulandı. Ayrıca yapılan çapraz reaksiyonla saf monoklonal antikorların herhangi bir çapraz reaksiyon göstermediği, sadece LPG molekülüne karşı cevap oluşturduğu ortaya çıkarıldı. Sonuç olarak; Bilim, Sanayi ve Teknoloji Bakanlığı tarafından desteklenen 0254.STZ.2013-2 numaralı proje kapsamında, Dünya'da ve ülkemizde ilk kez olarak Kütanöz Leishmaniasis etmeni L.tropica'nın immünojenik yüzey molekülü olan lipofosfoglikana (LPG) karşı hibridoma teknolojisine dayalı monoklonal antikorlar elde edilmiştir. Elde edilen bu sonuçlar, L.tropica'dan izole edilen LPG molekülüne karşı hibridoma teknolojisine dayalı olarak geliştirilen monoklonal antikorların, bu moleküle karşı yüksek düzeyde spesifiklik gösterdiğini ve bu nedenle elde edilen monoklonal antikorların gelecekte kütanöz leishmaniasis tanısında kullanılmasının uygun olabileceğini ortaya çıkarmıştır.