Nanopartikül-glukantim ve nanopartikül-Nigella sativa yağ kombinasyonlarının Leishmania tropica'ya  karşı antileishmanial etkilerinin in vitro ve in vivo incelenmesi ve Kütanöz leishmaniasis'in tedavisinde yeni yaklaşımlarının geliştirilmesi

EMRAH ŞEFİK ABAMOR

Nanopartikül-glukantim ve nanopartikül-Nigella sativa yağ kombinasyonlarının Leishmania tropica'ya karşı antileishmanial etkilerinin in vitro ve in vivo incelenmesi ve Kütanöz leishmaniasis'in tedavisinde yeni yaklaşımlarının geliştirilmesi

Tezin Türü: Doktora

Tezin Yürütüldüğü Kurum: Yıldız Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, BİYOMÜHENDİSLİK ANABİLİM DALI, Türkiye

Tezin Onay Tarihi: 2014

Tezin Dili: Türkçe

Öğrenci: EMRAH ŞEFİK ABAMOR

Danışman: Adil Allahverdiyev

Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu

Özet:

Leishmaniasis dünyanın ve ülkemizin önemli halk sağlığı problemlerinden birisidir. Dünyada 350 milyon kişi Leishmaniasise yakalanma riski altındadır. Hastalık dünyanın 98 ülkesinde endemik olup, enfekte kişilerin sayısı ise 12 milyondur. Hastalığın klinik olarak kütanöz, mukokütanöz ve visseral formları bilinmektedir. Türkiye'de hastalığın visseral ve kütanöz formları yaygın olup, 20 milyondan fazla insan KL'nin tehdidi altındadır. Kütanöz Leishmaniasis (KL), genellikle yüz ve el gibi açık bölgelerde yıllarca iyileşmeden kalabilen ve ciddi estetik kaygılara yol açan yara izlerinin oluşmasına neden olan tedavisi oldukça zor endemik bir hastalıktır. Hastalık uzun yıllar boyunca kronik olarak devam edebilmektedir. Hastalık sırasında oluşan yara izlerinin kalıcı olması nedeniyle hastalarda psikolojik ve travmatik rahatsızlıklar da görülmekte, hatta bazı hastaların intihara sürüklendiği bilinmektedir. Bölgemizde son yıllarda yaşanan savaşlar nedeniyle artan göç hareketlerine bağlı olarak hastalığın epidemiyolojik durumu daha da ciddi hale gelmiştir. KL'nin tedavisinde çeşitli tedavi yöntemleri kullanılmasına rağmen, tedavide her zaman başarılı sonuçların elde edilmesi mümkün olmamaktadır. Mevcut antileishmanial ilaçların yüksek toksisiteye neden olması en büyük dezavantajlarıdır. Bunun yanında, son yıllarda hastalık etkenlerinde kullanılan ilaçlara karşı direnç geliştiği bildirilmektedir. Ülkemizde de özellikle Çukurova Bölgesi'nde KL'nin tedavisinde kullanılan antimonial ilaçlara karşı klinik açıdan dirençlilik geliştiği tespit edilmektedir. Ayrıca günümüze kadar Kütanöz Leishmaniasis'e karşı aşı geliştirilmesinde de başarılı sonuçlar elde edilememiştir. Böylece Gerek dünyada gerekse de ülkemizde hastalık ile mücadelede etkin bir ilacın ve aşının bulunmaması, aynı zamanda son yıllarda dünyada ve ülkemizde Leishmania parazitlerinde kullanılan antileishmanial ilaçlara karşı dirençliliğin gelişmesi problemi daha da güncel hale getirmiştir. Bu nedenle DSÖ KL ile mücadele için acilen yeni yaklaşımların geliştirilmesini önermektedir (WHO,2010). Günümüzde KL'nin tedavisine yönelik çalışmaların temelini sentetik ve bitkisel ilaçlar oluşturmaktadır. Ancak sentetik ilaçlardan biri olan pentavalent antimonların tedavideki başarılarını arttırmak ve mevcut dezavantajlarını giderebilmek için, diğer antileishmanial ilaçlarla ve bileşiklerle birlikte kombinasyon halinde uygulanması önerilmektedir. Kombinasyon terapilerinin avantajı düşük dozlarda uygulanan ilaçların birbirlerinin etkinliklerini arttırmaları, buna karşılık toksisitelerini de azaltmalarıdır. Ancak, uygulanan bu kombinasyon terapilerinde de her zaman yeterli sonuçlar elde edilememektedir. Antimikrobiyal uygulamalarda kemoterapinin etkinliğinin temelini, herhangi bir enfeksiyona karşı olan ajanın hücre içerisine yeterli düzeyde dahil olması oluşturmaktadır. Buna göre de, antileishmanial ilaçların ister tek başına isterse de kombinasyon halinde daha etkin olabilmesi ajanların hücre içerisine yüksek miktarda dahil olmasıyla mümkün olabilir. Bu nedenle, bahsi geçen kombinasyon uygulamalarının tedavideki yetersizliğinin esas nedenlerinden birisi; hücre içerisine yeterli miktarda antileishmanial ajanın girememiş olması olabilir. Ayrıca, uygulanan kombinasyonları oluşturan komponentlerin antileishmanial etkinliklerinin düşük olması da kombinasyon terapilerinin başarısını azaltabilir. Buna göre de kombinasyon terapilerinin etkinliğini arttırmak amacıyla, kombinasyonu oluşturan bileşiklerin hücre içerisine yüksek konsantrasyonlarda dahil olması ve yüksek antileishmanial etkinlik gösteren komponentlerden oluşması oldukça önemlidir. Son yıllarda Leishmaniasisin tedavisinde bitkisel yağların kullanımı alternatif tedavi yaklaşımı olarak önem kazanmaktadır. Ancak bitkisel yağların tek başlarına toksik olması ve yeterince etkin olmaması bu yönde yapılan çalışmaların değerini düşürmektedir. Ayrıca son yıllarda nanoteknoloji alanındaki gelişmeler ve nanoteknolojinin mikrobiyolojide uygulamaları kemoterapi alanında yeni ümitlere yol açmaktadır. Nano boyuttaki partiküller sahip oldukları geniş yüzey alanları ve mikro boyutlarına göre oldukça farklı özellikleri nedeniyle tıp alanında tanıda ve özellikle de tedavide kullanılmaya başlanmıştır. TiO2-Ag nanopartiküllerinin sahip oldukları geniş yüzey alanları sayesinde hücre membranlarının geçirgenliğini bozarak ilaçların ve antileishmanial bileşiklerin hücre içerisinde yoğun miktarda birikmesine neden olabileceği düşünülmektedir. Daha önce yaptığımız ön çalışmalarda, ilk kez olarak içerdikleri antimikrobiyal özellikli gümüş iyonları ve Leishmania parazitlerinin duyarlı oldukları bilinen reaktif oksijen türlerini (ROS) üretmelerine bağlı olarak, TiAgNp'nin yüksek düzeyde antileishmanial aktivite gösterdikleri belirlenmiştir. Ancak bu nanopartiküllerin de Leishmania parazitleri üzerinde etkin olan konsantrasyonları hücreler üzerinde sitotoksik etki gösterdiğinden tek başına kullanılması mümkün değildir. Böylece, nanopartiküllerin yukarıda bahsedilen özelliklere sahip olması (membran geçirgenliğini arttırması, yüksek düzeyde antileishmanial özelliğe sahip olması) ve aynı zamanda bitkisel yağların da yüksek antimikrobiyal özelliğe sahip olması Leishmaniasisin tedavisinde büyük bir potansiyel oluşturmaktadır. Ancak, bu bileşiklerin tedavide uygulanabilmesi onların toksik özelliklerinin giderilebilmesi şartıyla mümkün olabilir. Bu açıdan, düşük konsantrasyonlarda bu bileşiklerin kombinasyon halinde uygulanmasıyla toksisite sorununun önüne geçilebilir. Literatürde ise konuyla ilgili herhangi bir çalışmaya rastlanmamaktadır. Bu nedenle bu tez çalışmasının amacı; L.tropica parazitlerinin in vitro promastigot, amastigot-makrofaj kültürlerinde, in vivo olarak ise KL modeli oluşturulmuş deney hayvan modellerinde nanopartikül-antileishmanial ilaç ve nanopartikül-bitkisel yağ kombinasyonlarının ilk kez olarak antileishmanial etkinliklerinin incelenmesi ve Kütanöz Leishmaniasis'in tedavisinde nanoteknolojiye dayalı yeni yaklaşımların geliştirilmesidir. Nanopartiküllerin sahip oldukları geniş yüzey alanları sayesinde hücre membranlarının geçirgenliğini arttırarak ilaçların ve bitkisel yağ gibi bileşiklerin hücre içerisinde yoğun miktarda birikmesine neden olabilmeleri, ayrıca serbest radikalar gibi antimikrobiyal özeliğe sahip bileşikleri üretmelerini göz önünde bulundurularak, hem nanopartiküllerin hem de antileishmanial bileşiklerin kullanılan miktarlarını minimuma indirmek suretiyle KL'nin tedavisinde nanopartikül-antileishmanial ilaç ve nanopartikül-bitkisel yağ içeren kombinasyonların geliştirilmesi çalışmanın hipotezini oluşturmaktadır. Hipotezin gerçekleşmesi durumunda, mevcut antileishmanial ilaçların etkinliğinin arttırılması, parazitlerde ilaçlara karşı gelişen direncin minimum seviyeye indirilmesi, nanopartiküllerin, bitkisel yağların ve ilaçların toksisitesinin azaltılması öngörülmektedir. Bu amaç doğrultusunda; öncelikle sentezlenen TiAgNp'nin SEM, TEM ve Zeta-Sizer kullanılarak karakterizasyonu yapılmıştır. Daha sonra, sentezlenen TiAgNp'nin, ticari olarak elde edilen N.sativa yağlarının ve bir antileishmanial ilaç olan glukantimin J774 makrofaj hücreleri üzerindeki sitotoksisiteleri belirlenmiştir. Bunu takiben, ajanların toksik olmayan konsantrasyonları kullanılarak, TiAgNp-glukantim ve TiAgNp-N.sativa kombinasyonları hazırlanmıştır. Hazırlanan kombinasyonların etkinlikleri öncelikle L.tropica promastigotlarının in vitro kültürü üzerinde incelenmiştir. MTT, thoma lamında sayım ve Flow sitometrik analiz yöntemleri kullanılarak, kombinasyonların L.tropica promastigotlarının metabolik aktiviteleri, proliferasyonları ve canlılıkları üzerindeki etkinlikleri araştırılmıştır. Daha sonra, TiAgNp-glukantim ve TiagNp-N.sativa yağ kombinasyonlarının L.tropica amastigot-makrofaj kültüründeki etkinliği makrofajların enfeksiyon indekslerinin hesaplanmasıyla ve amastigot MTT yöntemiyle belirlenmiştir. Ayrıca kombinasyonlara maruz kalan enfekte makrofajların ürettikleri Nitrik Oksit (NO) miktarı Griess reaksiyonuyla hesaplanmıştır. Bunu takiben TiAgNp-glukantim ve TiAgNp-N.sativa yağ kombinasyonlarının KL modeli oluşturulmuş Balb/C deney hayvanları üzerindeki in vivo antileishmanial etkinlikleri incelenmiştir. Farelerde KL modelinin oluşturulması için 1 x108 L.tropica promastigotu farelerin sol ayak tabanlarına enjekte edilmiştir. KL modelinin oluşturulduğu farelerin ayaklarının çapı tedavi öncesinde ve sonrasında kapiler yardımıyla ölçülmüş, enfeksiyon bölgesinden elde edilen aspirat örneklerindeki parazit varlığı ise Mikro Kültür Yöntemi (MKY) kullanılarak mikroskobik olarak incelenmiştir. Veriler, SPSS version 19.0 for Windows programı ile belirlenmiş ve p < 0,05 değeri istatistiki olarak anlamlı kabul edilmiştir. Sonuç olarak; TiAgNp-glukantim kombinasyonunun Leishmania promastigotlarının proliferasyonunu ve metabolik aktivitesini 2 ila 6 kat arasında azalttığı, hücreleri % 53 oranında apoptoza sürüklediği gösterilmiştir (p<0.05). Aynı zamanda, kombinasyon uygulamasının parazitlerle enfekte makrofajların enfeksiyon indeksinde kontrol grubuna göre 20 kata varan azalmalara neden olduğu, L.tropica amastigotlarının metabolik aktivitesini ise kontrol grubuna göre 5 kat azalttığı tespit edilmiştir. Bununla birlikte, enfekte makrofajların ürettikleri NO miktarını 2 ila 5 kat arasında değişen değerlerde arttırdığı tespit edilmiştir. Tez kapsamında kullanılan bir diğer kombinasyon olan TiAgNp-N.sativa yağ kombinasyonu ise, L.tropica promastigotlarının proliferasyonunda ve metabolik aktivitesinde %96'ya varan oranda azalmaya neden olmuştur. Aynı kombinasyon L.tropica amastigotlarıyla enfekte makrofajların enfeksiyon indeksi değerini kontrol grubuna göre 20 kat, amastigotların canlılığını ise yaklaşık 6 kat azaltmıştır. TiAgNp-N.sativa yağ kombinasyonlarına maruz kalan enfekte makrofajların ürettikleri NO miktarının ise yaklaşık 9 kat arttığı gözlenmiştir (p<0.05). TiAgNp-glukantim ve TiAgNp-N.sativa yağ kombinasyon uygulamalarının farelerde oluşan KL'e özgü lezyonların iyileşmesine, ayaklarındaki şişliklerin ise azalmasına neden olduğu gösterilmiştir. TiAgNp-glukantim kombinasyonunun, KL'e özgü yaraların iyileştirilmesinde, mevcut konvansiyonel ilaç uygulamalarından daha yüksek etkinliğe sahip olduğu, TiAgNp-N.sativa yağ kombinasyonlarının ise konvansiyonel ilaç uygulamasıyla aynı düzeyde etkinlik gösterdiği belirlenmiştir. Böylece bu tez çalışması kapsamında; literatürde ilk kez olarak, mevcut antileishmanial ilaçların dezavantajlarını barındırmayan, toksik özellik göstermeyen, yüksek antileishmanial özelliğe sahip nanopartikül-glukantim ve nanopartikül-bitkisel yağ kombinasyonları gibi farklı modeller kullanılarak KL'nin tedavisinde nanoteknolojiye dayalı yeni yaklaşımların geliştirilmesinin mümkün olduğu gösterilmiştir. Antileishmanial etkinliği yapılan in vitro ve in vivo çalışmalarda belirlenen kombinasyonların gelecekte pre-klinik çalışmalarda kullanılmasının, KL'e karşı yeni tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesinde oldukça önemli olduğu düşünülmektedir.