MUŞMULA (Mespilus germanica) POLİFENOL OKSİDAZ ENZİMİNİN SAFLAŞTIRILMASI VE KARAKTERİZASYONU
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Yıldız Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, KİMYA ANABİLİM DALI, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2023
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: AYŞİN ÇAVDAR
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): Çiğdem Bilen
Eş Danışman: Emine Karakuş
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Enzimatik esmerleşme reaksiyonlarını gerçekleştiren polifenol oksidaz (PFO) enzimleri, oksidasyon tepkimelerini katalizlemektedir. Enzimatik esmerleşme reaksiyonları, meyve ve sebzelerin içeriğinde bulunan fenolik maddelerin PFO enzimi katalizörlüğünde o-kinonlara hidroksilasyon ve oksidasyon reaksiyonları ile sağlanmaktadır. Hidroksilasyon ve oksidasyon reaksiyonlarından sonra o-kinonların enzimatik olmayan oksidasyonu ve polimerizasyonu sonucunda melanoidinler oluşur. Gerçekleşen bu reaksiyonlar sebebi ile ürünlerde esmerleşme meydana gelmektedir. Mespilus germanica muşmula, sağlık yararları sebebi ile ticari pazar değeri kazanmış bir meyvedir. İçeriğinde bulunan antioksidan ve mineral özellikleri sebebi ile enzim kaynağı olarak kullanılmıştır. Yapılan tez çalışmasında Mespilus germanica muşmulanın saflaştırılması amacıyla ilk olarak, %0-80 amonyum sülfat ile çöktürme işlemi yapılmıştır, ardından diyaliz işlemi ile kısmen safsızlıklardan uzaklaştırılan polifenol oksidaz enzim ekstraktı (KSP enzimi) elde edilmiştir. Elde edilen KSP enziminin en yüksek enzim aktivitesine sahip olduğu optimum reaksiyon koşullarının tespit edilebilmesi amacıyla karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Enzimin kafeik asit, katekol, progallol ve 4-metil katekol substratları ile ilk olarak optimum substratı tespit edilmiş ve bu substrat üzerinde çalışılarak, optimum konsantrasyon, optimum pH ve optimum sıcaklık çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Yapılan bu çalışmalar için elde edilen optimum koşullar katekol substratı için sırasıyla 0.1M/ pH:6.8/ 15°C; olarak belirlenmiştir. Enzimin optimum substratı için Vmax ve KM kinetik sabitleri ise sırasıyla; 12542.46 EU ve 2.5 mM olarak hesaplanmıştır. Çalışmanın devamında ise, kısmen safsızlık içeren KSP enzim özütü Sefaroz 4B-L-tirozin-p-amino benzoik asit ve Sefaroz 6B-L-tirozin-p-amino benzoik asit afinite jelleri ile saflaştırılmıştır. Elde edilen PFO enziminin saflık kontrolü ve molekül kütlesinin tespit edilebilmesi amacıyla doğal jel elektroforezi (NATIVE PAGE) ve sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) yöntemi uygulanmıştır. Muşmula PFO diyaliz numunesinde SDS-PAGE ile yaklaşık olarak 40 kDa ve 35 kDa'da iki bant gözlenirken, Native-PAGE ile 40 kDa ve 70 kDa'da iki bant elde edilmiştir. Dolayısıyla muşmulada molekül agırlıkları 40 kDa ve 35 kDa'luk özdeş iki alt birim içeren 70 kDa olan iki PFO izoenzim olabileceği şeklinde yorum yapılmıştır. Afinite kromatografisi ile saflaştırılan örnekler için ise Native-PAGE 'de yaklaşık 40 kDa civarında tek bant gözlendiğinden, muşmula PFO izoformlarından birinin afinite kromatografisi ile saflaştırıldığı yorumu yapılmıştır. Sefaroz-4B-L-tirozin-p-amino benzoik asit ve Sefaroz-6B-L-tirozin-p-amino benzoik asit afinite jelleri kullanılarak saflaştırılan Mespilus germanica PFO enzimi için sırasıyla 53,96 ve 7,26 saflaştırma katsayısına ulaşılmıştır.