Farklı Şaperon Plazmitleri Kullanılarak Escherichia coli'de Rekombinant Omp25 Proteinin Ekspresyonunun Optimizasyonu

---

Tezin Türü: Yüksek Lisans

Tezin Yürütüldüğü Kurum: Yıldız Teknik Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, Türkiye

Tezin Onay Tarihi: 2020

Tezin Dili: Türkçe

Öğrenci: Kübra TRABZONLU

Danışman: Tülin Arasoğlu

Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu

Özet:

E.coli, kısa sürede hızlı bir şekilde kültüre alınabilmesi ve yüksek verimli protein üretimi gibi sahip olduğu avantajlar nedeniyle rekombinant protein üretimi için en yaygın kullanılan konakçı organizmadır. E.coli sitoplazma, birçok avantajı nedeniyle yüksek düzeyde protein üretimi için en çok tercih edilen hücresel bölmedir. Ancak bu kompartmanda protein üretimi sıklıkla inklüzyon cisimcikleri oluşumu ile sonuçlanır. E.coli' de inklüzyon cisimcikleri olarak üretilen rekombinant proteinler; inaktif, agregat oluşturan, çözünmeyen, genellikle doğal olmayan moleküler disülfit bağlara ve olağandışı serbest sisteinlere sahip yapılardır. Aktif proteinin inklüzyon cisimlerinden in vitro olarak geri kazanımı büyük ölçekli üretim için çok pahalı olabildiğinden bu proteinlerin doğal üç boyutlu yapı oluşumunu sağlamaya yönelik stratejiler günümüzde önemi korumaktadır. Sunulan çalışmada sitoplazmada inklüzyon cisimciği oluşturduğu bilinen ve bruselloza hastalığına karşı majör antijenlerden olan rekombinant Omp25 proteininin; farklı moleküler şaperonlar kullanılarak sıcaklık ve indükleyici konsantrasyonu açısından ekpresyonun indüklenmesi stratejileri ile protein çözünürlüğü ve doğru katlanmanın arttırılması hedeflenmektedir. Çalışmada DnaK/DnaJ/GrpE/GroES/GroEL ve trigger faktör sitoplazmik şaperonlarını farklı kombinasyonlarda içeren pG-KJE8, pGro7, pKJE7, pG-Tf2, pTf16 şaperon plazmitleri kullanılmış, iki ayrı sıcaklık ve iki ayrı IPTG konsantrasyonu çözünürlüğün artırılması için optimizasyon parametreleri olarak değerlendirilmiştir. Sonuçlar, 25 °C'de indüklenen ekspresyonun 30°C'de ekspresyona kıyasla supernatanttaki toplam protein miktarını artırdığı ancak Omp25 proteininin çözünürlüğüne etkisinin olmadığını göstermiştir. Aynı şekilde indükleyici konsantrasyonu yarıya düşürülerek yapılan çalışmada, rekombinant Omp25 proteininin çözünürlüğüne anlamlı bir etkisi gözlemlenmemiştir. Yapılan çalışmalar SDS-PAGE ve Western Blot analizleriyle doğrulanmıştır.