Metagenomik yaklaşımla elde edilen endoglukanaz enziminin rekombinant ekspresyonu ve karakterizasyonu
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Yıldız Teknik Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2022
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: Furkan Abdullah Çalış
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): Emel Ordu
Eş Danışman: Günseli Kurt Gür
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Selülazlar, O-bağlantılı glikozitleri hidrolize eden glikozid hidrolazlardır. Bunlar esas olarak endoglukanaz (EC 3.2.1.4), ekzoglukanaz / sellobidrohidrolaz (EC 3.2.1.176/EC 3.2.1.91) ve beta-glukozidazdan (EC 3.2.1.11) oluşan sinerjistik olarak işleyen bir enzim sistemi oluşturmaktalardır. Endo-β-1,4-glukanazlar, selüloz polimerlerinde iç amorf bölgelere rastgele saldırarak yeni zincir uçları oluşturmakta ve rastgele uzunlukta daha küçük selüloz parçalarını serbest bırakabilmektedir. Selülazlar genellikle mantarlardan elde edilmekle birlikte bakterilerin yüksek büyüme hızları, etkili kompleks enzimleri üretebilmeleri ve enzim üretimini arttırmak için genetik mühendisliğinin kolay uygulanabilir olması nedenleriyle önemli olduğu düşünülmektedir. Son araştırmalar, bakteri çeşitliliğinin bitki polimer bozulmasında önemli olduğunu ve bu mikroorganizmalardan ilgili genlerin ve enzimlerin izole edilmesinde geleneksel kültüre alma yöntemlerinden bağımsız metagenomik yaklaşımın giderek arttığını göstermektedir. Metagenomik, çevredeki mikroorganizma topluluklarını kültüre almadan doğrudan tüm topluluğun genomik DNA'larının izole edilmesidir. Bu sayede, kültür koşullarının optimizasyonuna gerek kalmadan ya da kültüre alınamayan mikroorganizmaları gözden kaçırmadan mikrobiyal genetik çeşitlilik ve biyoteknolojik potansiyelin araştırılması sağlanmaktadır. xiii Çalışmamızda önceki başka bir çalışmada kompost topraktan kurulan fozmit-metagenomik kütüphanenin aktivite temelli taranması sonucu tespit edilen yeni bir endo-β-1,4-D-glukanaz enzimini kodlayan gen, öncelikle pJET1.2/blunt vektörüne klonlanmıştır. 1134 nükleotitten oluşan tam uzunluktaki rekombinant β-1,4-D endoglukanaz geni, amplifiye edilen ürünün dizi analizi yoluyla tanımlanmıştır. Daha sonra pQE-2 ekspresyon vektörüne aktarılan genin heterolog ekspresyonu Escherichia coli BL21 (DE3) 'de yapılmıştır. ORF, tahmini moleküler ağırlığı 42.82 kDa olan 378 amino asitlik bir proteini kodlamaktadır. N-terminal ucundaki sinyal dizisinin kesilmesinin ardından saflaştırması optimize edilerek endüstriyel uygulamalarda biyoteknolojik potansiyele sahip bu yeni enzimin aktivitesi değerlendirilmiştir. N-terminal sinyal dizisi kesilmiş genle karşılaştırıldığında, tam uzunluktaki rekombinant β-1,4-D endoglukanaz geni taşıyan E. coli'de selülaz üretiminde dört kat daha az ekspresyon sergilemiştir. Ayrıca sinyal dizisi uzaklaştırılmış geni bulunduran hücreden elde edilen süpernatanda, hücre peletinden daha yüksek enzim aktivitesi gözlenmiş olup sinyal dizisi uzaklaştırılmasının daha fazla hücre içi çözünebilir β-1,4-D endoglukanaz üretimini sağladığı gözlemlenmiştir. Enzim aktivite sonuçları metagenomik kütüphane kaynaklı elde edilen bu yeni selülazın biyoetanol üretiminde selülozik madde parçalanmasında kullanılmak üzere endüstriyel uygulamalar için potansiyele sahip olduğu düşünülmektedir.