Gossypium Hirsutum Format Dehidrogenaz Enzimi Üzerine Bölge Doygunluk Mutasyonu Uygulamaları

3. Ulusal Proteomik Kongresi, İstanbul, Türkiye, 27 - 29 Şubat 2020, ss.24

Yayın Türü: Bildiri / Özet Bildiri
Basıldığı Şehir: İstanbul
Basıldığı Ülke: Türkiye
Sayfa Sayıları: ss.24
Yıldız Teknik Üniversitesi Adresli: Evet

Özet

Amaç: NAD+-bağımlı format dehidrogenazlar (FDH, EC 1.2.1.2), format ve NAD+’ın karbondioksit ve NADH’ye dönüşümünü katalize etmektedir. Dolayısıyla kiral olarak saf alkollerin oluşturulması için aldehitlerin ve ketonların enzimatik indirgenmesinde kullanılması gereken ve pahalı bir koenzim olan NADH’nin rejenerasyonunda önemli bir potansiyele sahiptir. NAD+ - bağımlı format dehidrogenazlarla ilgili literatür incelendiğinde FDH ile ilgili çalışmaların mikroorganizmalar üzerinde yoğunlaştığı, bitki kaynaklı FDH’lerin biyoteknolojik kullanılabilirliğinin değerlendirilmesinde önemli bir boşluk olduğu görülmektedir. Bu nedenle çalışmamızda pamuk bitkisinden izole edilerek E.coli konakçı hücresinde rekombinant olarak ekspresyonu yapılmış olan Gossypium hirsutum FDH (GhFDH) enziminin NAD(P)H rejenerasyonu ya da karbondioksit redüksiyonu gibi biyoteknolojik uygulamalarda kullanılma potansiyelinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, koenzim spesifitesini geliştirmek üzere Arabidopsis thaliana FDH enziminin üç boyutlu yapısına dayalı olarak oluşturulan homoloji model üzerinde koenzim bağlanma spesifitesinden sorumlu bölge tespit edilerek doygunluk mutasyonu uygulanması yapılmıştır.

Yöntem: Bölge doygunluk mutasyonu ile hedef bölgeye uygun dejenere primerler kullanılarak PCR yoluyla akıllı mutant kütüphane oluşturulmuştur. Aktivite taramasıyla başarılı mutantlar seçilmiş ve seçilen mutantların overekspresyonu gerçekleştirilerek yüksek saflıkta proteinler elde edilmiştir.

Bulgular: Mutant GhFDH’nin overekspresyonunun ardından SDS-PAGE yöntemi ile mutant proteinin>%95 oranında saflaştırılabildiği tespit edilmiştir. Aktivite taramaları sonucu belirlenen bazı mutantların yabanıl tip GhFDH’ye göre daha yüksek aktivite değerleri gösterdiği belirlenmiştir.

Sonuç: Mutant GhFDH enzimlerinin aktivite ve stabilite karakterizasyonu çalışmaları devam etmektedir. Elde edilecek mutantların koenzim spesifitelerinin geliştirilmiş olması beklenmektedir.

Bu çalışma Yıldız Teknik Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinatörlüğü tarafından desteklenmektedir: Proje Numarası: FYL-2020-3787.